利用液滴微流体技术提高尿细胞图像分割效率

运用机械视觉识别生物样本的最新开展使该技巧正在商讨和检测中变得越来越紧张。图像朋分是这一进程中的紧张一步。本商讨的核心是怎样依据微流体省略区别类型（或统一类型内）尿细胞之间的重叠等搅扰要素，并降低细胞图像的机械视觉朋分精度。正在这项商讨中，咱们阐明了该平台也许以尿细胞图像朋分为例达成这一假设。咱们最先斟酌报道的尿细胞液滴微流控芯片体系，该体系能够达成将尿细胞封装正在液滴中并从盐结晶和/或细菌和其他尿液造成元素平分离出来的测试要求。然后，依据前述实行中设定的剖判要求，衡量统一尿样中总尿细胞中各样造成元素掩盖的红细胞、白细胞和鳞状上皮细胞的比例。咱们同时剖判了盐结晶掩盖的尿细胞百分比和尿细胞之间重叠的爆发率。末了，运用Otsu算法对液滴封装的尿细胞图像和未被液滴封装的尿细胞图像举办朋分，并阴谋骰子、Jaccard、精度和召回率值。结果阐明，基于液滴的单细胞封装设施正在不优化算法的情状下，能够降低图像朋分成效。

正在心理要求下，尿液中含有白细胞（WBC）和上皮细胞等元素。当患者患有膀胱癌时，膀胱肿瘤细胞能够通过尿液分泌。1通过这种体例，尿液中细胞类型的液体活检，十分是肿瘤细胞的检测，有助于膀胱癌和泌尿体系疾病的诊断。目前，正在临床医学检验中，主动检测技巧为尿液细胞学铺平了道途。2

主动化尿浸渣剖判技巧的映现，使其正在临床医学检验范围取得急忙利用。3随后，很众商讨评估了尿浸渣剖判体系的检测成效。据报道，主动尿浸渣剖判体系检测碱性尿颗粒的告成率为73%-98%。4当尿液中存正在高浓度的细菌和/或酵母时，尿液中的红细胞（RBC）值显着补充，这相应地补充了检测尿细胞的舛误率。依据报道的商讨结果，这些浸积物剖判体系尚未抵达尿细胞确凿判定的水准，仍必要由细胞形式学专家举办判定，以讲演尿液细胞无误数目和类型的检验结果。5、6

依据临床体味，展现尿浸渣中尿细胞、盐晶体和病原微生物彼此重叠，或者尿盐晶体和粘液丝粘附正在尿细菌外貌。的确而言，对付患有尿途熏染，膀胱炎，膀胱癌和其他疾病的人，其他因素对尿细胞的掩盖率高于强健人。7、8

正在基于细胞形式识别尿细胞类型的进程中，尿细胞与其他造成元素之间的粘赞同/或重叠是导致尿细胞类型舛误识另外要素之一。9仍然有几份商讨讲演摸索图像识别模子以降低图像识别算法的机能。10克日有报道称，算法的纠正渐渐补充了细胞识别成效。票价：11、12依据目前的文献，正在临床利用机械视觉识别尿细胞的进程中，对影响尿液中细菌、盐晶体和其他可睹因素搅扰要素的因子举办识别尿细胞缺乏体系商讨。

近年来的商讨讲演阐明，基于微流控技巧，能够达成生物细胞的单细胞剖判，分子外达和遗传特性。票价：13、14值得留心的是，检测血液轮回肿瘤细胞的技巧仍然通过了美邦食物和药物管制局的认证。15郑和伊斯马吉洛夫16刻画了一种微流体体系，用于筛选数百种卵白质结晶要求，每个结晶液滴运用少于4nL的卵白质溶液。从那时起，基于液滴的单细胞剖判连续潜心于众个科学范围的发扬，比如单细胞代谢，17细胞免疫学，18细胞卵白质组学，19基因组学，20和药物筛查。21迩来，合于液滴微流控芯片技巧正在单细胞剖判中的利用仍然有很众商讨。液滴微流体技巧引入了两个不相容的液相，供给了对单个细胞的生物代谢特性和细胞图像特性的适应剖判，省略了其他要素的交叉污染，同时供给了高通量样品离散化的怪异上风。22运气的是，有商讨阐明微流体技巧能够达成图像识别。票价：23、24此中很众商讨纠合了图像识别和液滴分类技巧，以鞭策后续剖判，比如浮逛生物物种，25人类红细胞，26以至是3D细胞培育球。27基于这些商讨，咱们以为液滴微流体技巧有大概革新基于机械视觉的尿细胞识别结果。

本商讨商量了欺骗液滴微流控芯片技巧省略尿液中细菌、粘液、晶体等因素对阴谋机视觉设施提取的尿细胞形式特性的搅扰功用，进一步为纠正欺骗CAD体系剖判尿液细胞剖判技巧供给商讨根据。

依据临床诊疗指南，对临床诊断出的尿途熏染、膀胱癌、肾病归纳征患者的尿液举办只身搜聚。正在2小时内汇集的每个患者样本的10ml中，一部门用于尿细胞形式学诊断，另一部门用于以下实行。全豹人体原料都是依据经容许的机构审查委员会条约得回的。正在纳入之前，已得回全豹参加者的书面知情附和。

将尿液和Sternheimer-Malbin（S-M）染色溶液以4：1的体积比同化，染色时辰为3分钟。每个细胞由三位病理学家判定，并阴谋各品种型尿细胞的均匀百分比。

正在利用液滴微流体统治之前，运用iQ200主动尿液显微镜剖判仪（iQ200;IRIS，Chatsworth，CA）得回相合其内容的根基新闻，并对每个标本举办反复衡量三次以阴谋均匀值。咱们遴选并同化了10个包括很众区别类型的标本。同化标本用于天生足够的图像数据以供后续剖判。

微流体芯片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成。PDMS层的筑制设施如下：将预聚物与固化剂（Sylgard 184，道康宁，米德兰，MI）同化，将所得溶液以10：1的比例倒入预制面罩中并正在80°C下固化2小时;然后将固化的PDMS薄膜剥离并通过氧等离子体工艺粘合到玻璃基板上（Diener electronic，Ebhausen，德邦）。芯片掩模是运用AutoCAD（Autodesk;索萨利托，加利福尼亚州）。

设施 1：最大类间方差法 （Otsu）28用于将图像划分为前景（单位格）和靠山。用于图像朋分的大津设施的道理如下：

(1)内部类方差：(2)由于(3)然后(4)此中w0(t） 呈现按阈值t分类的两品种型的图像的前景像素比例：(5)w1(t） 呈现按阈值 t 分类的两品种型的图像的前景像素比例：(6)u{0，1，T}(t） 呈现前景、靠山和集体图像的均匀灰度值：(7)(8)(9)设施2：扩张和腐蚀，以滑腻图像的边沿。膨胀是团结与对象接触的全豹靠山点并向外扩展对象鸿沟的进程。膨胀能够填充前景图像中的小孔和小凹陷。构造元素B（靠山）到图像A（前景）的膨胀是A⊕B，界说为

(10)腐蚀是膨胀的双重操作，这是歼灭鸿沟点并使鸿沟向内萎缩的进程。腐蚀能够歼灭小而无旨趣的物体。构造元素B（靠山）对图像A（前景）的腐蚀是A⊖B，界说为(11)设施3：评估两组尿细胞图像的朋分结果。

正在尿细胞图像的商讨中，有两组细胞图像：一组是液滴封装的细胞图像组，另一组口舌封装组。对付每个细胞图像，细胞区域由细胞病理学专家和主动阴谋机辅助朋分设施标识。主动朋分与手动朋分设立筑设的地面实况举办了斗劲。运用几个评估参数（如骰子，Jaccard，精度和召回率）评估用于图像朋分的液滴微流体的机能。这些参数的阴谋设施如下：(12)(13)此中X和Y是指斗劲的两个朋分标签，此中一个是根基毕竟，十和是的划分指X和Y中的像素数。(14)(15)此中 TP = 真阳性，TN = 真阴性，FP = 假阳性，FN = 假阴性。体系的集体流程图如图1所示。微流控芯片的细节如图S1所示。

尿细胞剖判体系的集体流程图。（A）统一试样经由古代制膜和微流体体系两种设施。通过正在显微镜下运用CCD相机获取细胞图像，然后输入到阴谋机举办图像朋分。（B）尿细胞正在微流控芯片中造成液滴的进程。（C）主动细胞图像朋分[颜色图能够正在

该实行中运用的尿细胞来自患者的尿液样本。确定尿细胞类型的序次如下：最先，用S-M染色对尿细胞举办染色;然后，三名细胞病理学家对每个细胞举办形式学判定。对付统一细胞，当三位细胞病理学家中的一位或众位存正在争议时，该细胞被排斥正在本商讨中;之后，依据尿细胞的形式学特性，考察到白细胞，上皮细胞和红细胞中细菌，粘液丝和细胞之间重叠的形象（如图2所示）。末了，标识了由三位细胞病理学家判定的每个细胞的轮廓。

Sternheimer-Malbin（S-M）染色的尿细胞。（A）SECs和盐晶体的重叠。（B）白细胞（WBC）和长杆菌的重叠。（D）SEC的重叠;（E）红细胞（RBC）、细菌和WBCs的重叠;（F）WBC和粘液丝的重叠[颜色图能够正在

液滴微流控芯片体系搜罗载体注油通道、尿细胞注入通道和液滴储罐。微流控芯片体系的任务流程如下：最先，将载体油和尿细胞同时注入微流控芯片。然后，通过微流控芯片的流体动力学效应，将尿细胞逐一封装以造成液滴（如图1所示）。

为了商讨液滴发作的要求，当注入微芯片的微流体的总流速为6ml / h时，考察到微流体芯片中发作的液滴的直径。实行结果阐明，当油相与水相的比例抵达1.6（油= 3.7 ml / h，缓冲液= 2.3 ml / h）时，正在微芯片中考察到液滴。当比例越过2（油= 4.0 ml / h，缓冲液= 2.0 ml / h）时，液滴直径根基恒定。然而，当比率越过2.75（油= 4.4ml / h，缓冲液= 1.6ml / h）时，造成的液滴的直径显着区别（如图3（A，B）所示）。另一方面，咱们将两比拟固定正在2：1并调治总流量。正在每个流速下发作的液滴的直径相对划一（图3（C，D））。

正在各样参数要求下发作液滴。（A）液滴直径与所施加的油水流速比的合连性。咱们将注入开发的油相和水相的比例限度从1（3 ml / h：3 ml / h）调治为2.75（4.4 ml / h：1.6 ml / h）。（B）正在各样油水流速比要求下发作的液滴图像。I：1.5，II：1.6，III：1.7和IV：2.0。（C）液滴直径与施加的总流量之间的合连性。咱们将注入开发的总流速限度从0.6调治为6.0ml / h.（D）正在各样总流速要求下发作的液滴图像。I：0.6， II：0.75， III：1.5， 和 IV：3.0 [彩色图形能够正在

基于上述结果，咱们确定了以下参数：注入微流控芯片的总流速为6ml / h。油相的打针流量为4 ml / h，水相的喷射流量为2 ml / h。换句话说，注入芯片的总流速为6 ml / h，油相与水相的比例为2：1。

每个液滴内的细胞数目能够运用泊松分散来臆度，29此中，每个液滴找到x个细胞的概率P（X = x）由以劣等式给出：

欺骗液滴微流控技巧，将尿细胞封装正在液滴中，将尿细胞与尿液中的非细胞元素诀别，从而达成高通量样品离散化。咱们以为，当液滴中封装的细胞数目为0或1时，阴谋机视觉设施有助于识别尿细胞图像。

正在这项商讨中，当注入芯片的细胞浓度为2.7×104cell/ml，将细胞封装正在全盘芯片存储池中的液滴的阳性率小于1%。随后的实行是渐渐补充打针到芯片中的细胞数目。当打针到微芯片中的细胞浓度补充到2.7×106细胞/ml，芯片中细胞液滴的阳性率抵达21.08%（如图S2所示）。液滴的半径约为30μm，液滴的体积为113 pl。依据等式（16），阴谋结果为λ= 0.23，现实检测结果为λ= 0.21±0.08。据报道，由液滴微流体惹起的泊松分散大概会低落其高通量。31然而，本文旨正在商讨液滴微流体是否能够降低尿细胞图像的识别机能。另外，尚有众种设施能够克制液滴包封电池的泊松分散。32、33

对统一尿液样本举办两次实行。尿细胞的第一部门直接用S-M染色，并正在显微镜下得回细胞图像。将尿液细胞的第二部门打针到微流体芯片中，并得回由液滴封装的细胞的图像。正在两个实行中得回的每个细胞由三位细胞病理学家判定，以判定其细胞类型并手动标识细胞轮廓。然后，通过阴谋机视觉设施主动标识轮廓。实行结果阐明，正在尿细胞封装之前，尿细胞正在细胞之间重叠，被细菌掩盖或被盐晶体掩盖（图2）。尿液经液滴微流控装配统治后，尿细胞被包封正在液滴中。一个更显着的形象是，其他可睹因素，如尿粘液丝，细菌和染色溶液的残留物能够从液滴中排斥（图4）。

封装正在液滴中的尿细胞的图像。（A）液滴中的单红细胞（RBC）。（B）液滴中的单白细胞（WBC）。（C） 液滴中的单个 SEC。（D） 液滴中的细菌。（E）液滴中的盐晶体。（F）液滴外的纤维丝[颜色图能够正在

液滴芯片操作前后尿液中各样造成元素重叠和粘附的构成比例的统计剖判如外1所示。实行结果阐明，对付尿液中的三品种型的细胞（红细胞，白细胞和SEC），液滴包封后重叠率均显着低落。红细胞的重叠率低落了25.3%，白细胞的重叠率低落了67%，鳞状上皮细胞（SECs）低落了40%。另外，液滴不只封装正在尿液中的单个细胞（图4（A-C）），并且还诀别细菌（图4（D）），晶体（图4（E））和杂质（图4（F））。当尿液中含有细菌，盐晶体和杂质时，通过约100 pL的高通量液滴达成单细胞。综上所述，能够阐明液滴微流体具有低落阴谋机辅助尿细胞识别设施舛误率的潜力。

临床尿细胞检验的方针是确凿识别尿细胞的类型和数目。基于图像的检测显示了怎样确凿朋分细胞以及怎样从全盘载玻片图像中提取特性。摸索省略尿液中可睹光因素对图像朋分的搅扰的技巧将成为基于阴谋机视觉的细胞剖判的商讨热门。本商讨采用Otsu算法对封装和未封装的尿细胞举办朋分，运用Dice、Jaccard、精度和召回率来评估朋分结果。34咱们首要眷注尿液中3种细胞正在5种常睹搅扰情状下，共13个场景，如外1所示，并对封装前后的朋分成效举办了斗劲剖判。正在此之前，咱们采用古代设施，欺骗Otsu算法正在载玻片上朋分单个细胞，然后阴谋出本实行顶用于评估朋分成效的四个参数，以阐明咱们算法的可托度。另外，正在这项商讨中，这已被用作精良朋分成效的基线。将封装和未封装的尿细胞与标识区域的地面确凿值和算法朋分举办斗劲。末了，阴谋了两组每个样品的4个参数。正在基于古代尿细胞形式学技巧（非包封）的检测中，将尿细胞与其他粘附元件朋分正在沿途以造成最终的细胞图像（如图5所示）。正在对液滴微流控装配举办预统治后，能够确定RBC，WBC和SEC都得回了更好的朋分结果，这与地面毕竟高度吻合（图5）。实行结果阐明，红细胞、白细胞和SEC的Otsu朋分和人工朋分之间的4个值正在被液滴包封时均亲昵1且亲昵单个细胞的朋分成效，除非包封细胞召回外，三个值远小于1（如图6所示）。).这阐明，当被液滴封装时，尿细胞轮廓的相通性能够显着补充，这有利于基于阴谋机视觉的识别设施。

Otsu对封装和非封装细胞图像的朋分结果。（A）大津朋分和手动评释的斗劲。（B）正在预统治前后，正在含有（1）杂质，（2）线）单白细胞（WBC）和（4）包封正在液滴内的单个WBC的鸿沟盒内的Otsu朋分结果[颜色图能够正在

运用沟通的朋分算法，基于液滴包封的细胞和非液滴封装的细胞，阴谋尿细胞图像的四个评估参数。尿细胞的类型是白细胞（WBC），红细胞（RBC）和SEC。另外，咱们正在四项临床检验中考察到搅扰尿细胞形式学图像的机械搅扰要素对细胞图像识另外影响。此中，通过液滴微流体检测尿液预统治后的细胞图像只要单细胞一品种型，而基于非液滴包封细胞检测细胞的细胞图像搜罗五品种型的细胞图像，即细胞重叠、晶体掩盖、粘液丝掩盖、细菌掩盖和单细胞。

液滴微流控技巧具有高通量样品离散化的特色，为声援基于微流体的尿细胞图像剖判供给了外面根据。据咱们所知，这是初度运用液滴微流控芯片来诀别尿细胞，以基于阴谋机辅助设施达成更好的尿细胞图像朋分结果。目前，基于阴谋机视觉的设施降低细胞图像识另外机能能够从以下两个方面举办优化：一是降低图像识别算法的机能。合连商讨收效已正在临床试验中取得利用;此中，基于图像的尿细胞主动识别体系已成为阴谋机视觉和医学成像范围的热门线跟着阴谋机视觉的发扬，细胞图像识另外成效渐渐降低。37正在阴谋机视觉辅助临床医学诊断的现实利用中，许众病例都没有将完满的幻灯片图像用于操练数据，这是与降低医学图像识别才干合连的一个合头要素。38另一种是正在样品制备进程中去除搅扰物质。基于液体的细胞学是办理这一方面的办理计划。声援这种办理计划的根基外面是，少少商讨展现，基于液体的细胞制备技巧能够低落细胞之间的重叠比。39然而，这种从液体中汇集细胞的设施是否能够降低尿液细胞学真实凿性如故存正在争议。40、41

正在这项商讨中，咱们提出了另一种优化尿细胞的办理计划，以便图像能够合适细胞图像朋分算法。如图6所示，导致古代标本图像朋分不良的首要要素是精度低。相反，召回值不会发挥出较弱的发挥。咱们假设正在不纠正算法的情状下，对付尿液样本，该算法更有大概发作比假阴性更众的假阳性。这正在朋分标识图像中直观可睹，算法朋分更容易映现舛误扩展而不是舛误还原。42前者的根基原由是尿液中尚有其他造成的元素。43正在这项商讨中，尿液被液滴微流体装配离散化，以便每个造成的组分只身封装正在液滴中，因而最终的图像朋分更潜心于标的而不会受到其他造成元素的搅扰。对3种细胞的13种样品举办总结，包封前后，精度值从0.489±0.267补充到0.914±0.030，召回率值从0.768±0.242补充到0.983±0.009。咱们还通过衡量骰子和Jaccard值斗劲了算法的朋分和确凿值之间的相通性，总结了封装前后的3种细胞的13品种型样本;两个参数划分从0.501±0.217和0.373±0.225补充到0.947±0.018和0.900±0.032。必要留心的是，本实行结果阐明，包封前后细菌粘附的鳞状细胞的朋分成效没有分歧。原由是细菌和鳞状上皮的面积有很大区别，因而对最终参数的阴谋影响较弱。44然而，值得指出的是，细菌粘附的鳞状上皮会改观其自己的图像新闻，从而对进一步的识别发作倒霉影响。45封装后，这些细菌大部门能够被歼灭，这为进一步判定奠定了精良的根基。46咱们正在朋分单个单位格时运用参数值行为基线。能够看出，正在采用沟通算法的条件下，运用液滴微流控装配统治统一试样前后的四个参数均取得革新。更紧张的是，封装后的朋分成效与单个细胞的朋分成效相当，这阐明了咱们欺骗液滴微流控技巧达成生物图像朋分的假设是确凿的。图像朋分是影响后续统治设施机能的合头图像统治工作。47目前，液滴内细胞朋分算法正正在慢慢发扬。48、49另外，相合于运用液滴微流体技巧举办细胞图像剖判的报道，指出能够达成细胞类型的测定。50本商讨中提出的观点大概合用于涉及液滴微流体或图像识另外其他利用。

这项商讨供给了第一个观点验证迹象，阐明用液滴微流体封装单个细胞能够达成细胞图像朋分。为了特别这一观点的一个利用，咱们报道了一个液滴微流体平台，该平台能够将尿细胞封装正在液滴中，而细菌，盐晶体等则被排斥正在液滴之外。液滴微流控平台达成坚固液滴天生的要求是总流量务必为6ml / h，油相与水相的流速比务必为2。咱们阐明，正在运用液滴微流体后，四个参数，即骰子，杰卡德，精度和召回率，用于评估图像朋分降低了。更紧张的是，这些参数抵达了与朋分完满幻灯片图像时沟通的水准。另日，咱们将有有趣商讨液滴微流体与图像统治和识另外组合